退火温度对微滴式数字PCR仪的影响

 

　　微滴式数字PCR仪退火温度设置得太低可能导致非特异性PCR产物的扩增；退火温度过高可能会降低PCR扩增效率，降低目标产物的产量。

 

　　微滴式数字PCR仪理想的退火温度跟多个因素有关。要找到理想的Ta温度，需要尝试不同的温度下重复测试相同的反应体系，这需要耗费更多时间和试剂耗材。

 

　　其实与经典PCR反应一样，使用具有温度梯度功能的热循环仪可以很容易地确定微滴式数字PCR反应体系理想的退火温度，在一次实验中即可同时测试8个不同退火温度，以筛选出理想的温度条件。

 

　　所谓温度梯度，即在标准的96孔PCR仪中，各行/列在同一个温度步骤中产生不同的温度。在一次运行中即可考察不同温度对PCR扩增效果的影响，极大地减少实验次数，避免重复实验产生的不确定因素造成的影响。

 

　　对于某些难度更大的稀有突变检测实验中，由于野生型背景的干扰以及引物探针设计困难，很可能出现非特异性扩增。这时ddPCR体系的退火温度不仅要确保阳性微滴和阴性微滴的区分，还要确保仅发生非特异性的微滴与特异性扩增的微滴明确分开。

 

　　在没有温度梯度功能加持的情况下，相同的数字PCR体系优化和构建可能需要经过十数次重复实验来测试不同退火温度条件下的实验效果。此外也需要指出，并非所有的数字PCR技术都能通过温度梯度的方式优化检测体系，目前仅兼容标准PCR热循环仪的数字PCR平台才能使用温度梯度热循环程序。温度梯度功能是快速优化、构建数字PCR反应体系的利器，能大大减少体系优化阶段数字PCR试剂耗材的额外消耗，缩短工作时间，快速取得理想的实验结果。